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102. 細胞培養の基礎知識について. 8-6-98.

その1.細胞の培養について

 数年前は体外受精とか試験管ベビーなどという当時としてはあまり耳慣れない言葉が話題を呼びました。ところが、イギリスのある研究所でクローン羊「ドーリー」が全く新しい生殖技術で誕生したと話題になったばかりなのに、近頃は毎日のようにクローン牛が日本各地で矢継ぎ早に誕生している様子が、新聞などのマスコミで報道されています。詳しい技術的な内容はとても理解できないが、生殖革命とでも言うべきな新しい生命誕生の物語には、どれを読んでも「細胞の核を別な細胞に移植して培養する」という意味の言葉が常にでてきます。「細胞の培養」について、素人にも概要が把握できるように基本的なことを易しく説明して下さい、との質問を貰いました。普通の人にもイメージできるように易しく解説するのは、難しい問題ですが、解説を試みます。少し長くなりますが、お付き合いください。

本論に入る前に遺伝子と細胞の不思議さについて、私が思っていることを最初に記します。

その2.遺伝子の不思議.

 太古の昔から現代に至るまで1個の卵子と1匹の精子との合体によって1個の受精卵が作られ、1個の生物が生まれます。最初の1個の細胞である受精卵は、分裂に分裂を繰り返し数多くの細胞の塊になります。或る時突然に多細胞体の塊の表面にクビレが生じ、以後は細胞が分裂するたびに細胞数が増える細胞の増殖と細胞が特徴的な形態や機能を持った別な細胞に変化する細胞の分化と呼ばれる二つの異なる現象か次々と起こります。

 細胞の分裂と分化の結果、各種固有の細胞、臓器や個体が形作られます。ある細胞は、骨細胞、神経細胞、血液細胞、内分泌細胞、心臓などの各臓器の細胞、骨格細胞、その他となって、その細胞固有の機能を発揮するようになります。例えば、骨髄の細胞は血液細胞を作り出し、血液細胞は免疫抗体を産生します。また膵臓の細胞はインシュリンを、肝臓の細胞はアルブミンを、腎臓の細胞は造血作用をもつエリスロポイエチン等などを産生するようになります。

 インシュリンを作る膵臓の細胞は、アルブミンを作ることは決してありません。一見当たり前に見えるこの細胞の特徴は、実は大変に不思議な現象なのです。精子と卵子が合体してできた受精卵という最初の1個の細胞は、精子と卵子から受け取った1対の遺伝子を持っています。分裂・分化した後の全ての細胞に最初の細胞がもっていた1対の遺伝子は受け渡されている筈です。別な言い方をすると、個体を構成している全ての細胞は、全く同じ遺伝子を持っていることになります。各臓器および細胞では、同じ1対の遺伝子を持っていても全ての遺伝子は同じようには働かないようです。細胞特有の遺伝子、例えばインシュリンを作る遺伝子のみが働き、その他の遺伝子、例えばアルブミンを作る遺伝子は存在していても不活発な状態にあります。おきて活発に働いている遺伝子と居眠りをして怠けている遺伝子とが存在することになります。生命の基本は遺伝子といわれますが、その遺伝子に働きを命令する因子が存在するはずで、どんなものなのでしょう。

 赤血球erythrocyteは、赤芽球erythroblastと呼ばれる細胞が分化して形成されます。しかし、なにかの原因で、赤芽球が分化できずにそのまま体内で増え続けることがあります。この状態が続くと、生体内では赤血球が不足して病的な状態となり、赤芽球性白血病と呼ばれます。赤芽球をもう1回だけ分化させると、正常な赤血球にすることができます。インターフェロンは、このような作用を発揮するホルモン様物質です。

その3.細胞の不思議.

 女性由来の細胞は、いかに長期間試験管内で培養しても女性としての特徴を保ち続けます、黒人の子宮由来の細胞は、あくまでも黒人の子宮の細胞です。しかし、胃癌から取り出した細胞は、如何に培養しても試験管内では胃癌としての様相は示さず、単に胃癌由来の細胞に止まります。ところが、ヌードマウスと呼ばれる免疫異常のマウスに胃癌由来の細胞を植え付けると、もとの胃癌の構造に近い様相を示します。

 正常な二倍体の染色体を持っている培養細胞は、染色体が切断されたり壊れたりしない限り、本来の正常な性状を保ち続けます。正常な細胞は、前もって決められた寿命が存在し、永遠に殖えつづけることはできません。ガン由来の細胞または正常な細胞にガンウイルスを感染させた細胞は、決められた寿命の枠を超えて無限に増殖しつづけます。

 一方、我々の身体を構成している通常の細胞は、細胞を培養する容器の表面に付着しないと増殖せず、培養容器の表面では立体的に増殖することはなく、常に培養容器の表面で平面的に増殖します。ところが、ガンの細胞は、薄い膜のように平面的には増殖せず、細胞は固まり易く、容器の表面に付着しないで浮遊状態でも活発に増殖できます。血管の内皮細胞などはコラーゲンなどで表面処理をした培養容器の表面で無ければ増殖させるのは一般に難しいようです。ES細胞という特殊な培養細胞は、マウスに戻すと分裂・分化を繰り返しマウス個体を誕生させることができます。ES細胞にヒトの遺伝子などを導入すると、ヒトの遺伝子を持ったキメラマウスが生まれます。

 細胞を培養することによって、1個の細胞を1個の細菌のように取り扱うことができます。細菌には、酸素要求性の違いから、好気性細菌と嫌気性細菌とに分けられます。培養細胞は、全て好気性状態で培養されています。細胞が本来存在する生体内のような酸素分圧の低い環境で培養すると、細胞はどのようになるかはまだ解っていません。これから大変に興味が持たれる分野です。

その4.細胞培養技術小史.

 生体から組織や細胞を取り出し、これを人工的な環境(生体外)で生育・生存させる技術を細胞培養と呼びます。質問にありました細胞培養とは、細胞を培養する技術を指す言葉です。この細胞培養の技術を用いて生体外で生育・生存させた細胞を培養細胞と呼びます。これらの技術がいつ頃から発達してきたのかを知ってもらうために、次に簡単に歴史を紹介します。

 1907年Harrisonは、カエルの胎児組織のリンパクロット培養法(後で説明します)を用いて、細胞を試験管の内で増殖させることと分化させることに初めて成功しました。1913年 Steinhardは、ウサギとモルモットの角膜という膜組織を試験管内で生かしておく方法を用いて、天然痘ワクチンのウイルスの増殖実験に成功しました。1935年RiversとWard は、ワクチニアウイルスを数年にわたり植え継ぐことに成功し、天然痘の細胞培養ワクチンの製造に成功しました。1937年TheilerとSmithは、ニワトリ胎児の培養細胞を用いて黄熱ウイルスの毒力が弱まった弱毒ウイルスを分離し、弱毒生ワクチンを作りだしました。Carrel (1924-26)とMaitland (1931)はウイルスの宿主特異性の問題を、Andrews (1929-30)、Sabin(1935)と Rivers (1935)らはウイルス感染による細胞の変化を観察しました。1949年Endersは、ヒト体内では感受性の細胞は中枢神経系に限ると考えられていた小児麻痺を起こすポリオウイルスがヒト胎児の神経細胞以外の培養細胞で増殖することを証明しました。ノーベル賞に輝いたこの研究は、細胞培養の有用性と特異性を示した重要な先駆的な研究となりました。このように細胞を培養する技術の開発と培養した細胞の利用法は、ウイルスの研究者によって推進されてきたのです。

 時を同じくして幸運にもペニシリンやストレプトマイシンをはじめとする抗生物質の利用が可能になり、それまでは細胞を生体外で培養することは、細菌の混入との闘いで、細菌の増殖を抑制するのは神業的な技術をもった特別の人の特別な趣味のような道具でありました。抗生物質は、細菌汚染が障害になっていた技術的な問題を簡単に解決してくれました。更に、トリプシンなどの酵素やEDTAなどの細胞分散剤の利用によって均一な細胞の培養が可能となりました。

 細胞培養の利用は、放射性物質を用いた分子生物学的研究を可能にし、ウイルス遺伝子の存在様式や発現様式が理解できるようになりました。またセンダイウイルスによる細胞融合技術を用いた異種細胞間の雑種の形成は、発ガンの研究、単クローン抗体等の生理活性物質の産生、単細胞から個体の発生等に大いに貢献しています。

 更に、最近では、細胞を試験管内で維持させたり増殖させる技術が飛躍的に発達しましたので、生きている細胞から核を取り出し、その核を別な核を取り出してしまった生きていた細胞に移植できるばかりでなく、その核を移植された細胞を増殖させたり、分化させることも比較的簡単に行えるようになりました。これが、現代の生殖革命であるクローン動物の繁殖に拍車をかける時代を生み出しました。

代表的な細胞培養技術の進歩を列記すると、次のようになります。

  1. HeLa, FL, L, VERO, BSC-1, BHK-21等の株化細胞の確立により、容易に細胞が継代・維持できるようになりました。
  2. Puckの細胞をクローニングする技術およびHayflickによる2倍体正常細胞の培養技術により、遺伝的に均一な細胞集団の培養が可能となりました。
  3. 各種合成培地や粉末培地の開発により培養液の作製が極めて容易で安価となりました。
  4. 浮遊細胞の培養技術の発達により、細胞、ウイスル、インターフェロンや抗体等の大量培養が可能となりました。
  5. 蛍光抗体法の利用によって、培養細胞内に存在するウイルス等の抗原産生過程の観察ができるようになりました。
  6. 培養細胞を用いて染色体の観察が可能となりました。
  7. 放射活性物質を用いたラジオイムノアッセー法により、遺伝子の局在や発ガン機構等の分子生物学的研究が可能となりました。
  8. センダイウイルスによる細胞融合法を用いた細胞間雑種の形成が可能となりました。
  9. 雑種細胞の利用で単クローン抗体、生理活性物質等の大量培養が可能となりました。
  10. 細胞の凍結保存法の発達により、半永久的に細胞の保存と使用が可能となりました。
  11. 体外受精や核移植の技術革新により新しい生命の誕生が可能となり、新しい生物学の時代が始まりました。

その5.細胞培養と培養細胞の種類.

細胞の培養の仕方、培養された細胞の違いなどを、以下にひとまとめにして説明します。

1) 細胞の状態の違いによる器官培養と細胞培養

 器官培養は、器官の一部を生体外に切り出し、その器官そのまま栄養分を含む培養液に浸し、組織または細胞の生理的機能を保った状態で生かしておく培養技術てす。鼻や気管で繊毛と呼ばれる毛のような構造物を持っている気道の粘膜、細胞自身が収縮する機能を有する心筋、肝臓や腎臓なとに器官培養が利用されます。気管の繊毛を持った細胞にインフルエンザウイルスを感染させると、ウイルスが増殖して繊毛の動きは止まります。このような固有の機能を観察するのに便利です。細胞培養は、組織を生体外に取り出し、トリプシンなどの細胞分散剤を用いて組織を構成している細胞を一個の単位までバラバラにして、生体外の人工的な環境中で培養する技術です。培養された細胞は生体内で保持していた機能を発揮することはありません。サルの腎臓をバラバラの細胞状態にまで分散させ、単離した細胞を栄養液を加えて培養すると、数日で薄い膜のような細胞の単層が形成され、それに弱毒したポリオウイルスを感染させて、ポリオワクチンを作ります。

2) 大気との接触の違いによる密閉系培養と開放系培養.

密栓したビンで細胞を培養するビン培養(密閉系)とシャーレ培養(開放系)とに大別されます。

 ビン培養は、培養容器をゴム栓またはネジふたで密栓して細胞を培養する方法です。細胞は増殖するのにブドウ糖を利用し、二酸化炭素や乳酸などを作りますから、培養液のpHは培養期間に応じて次第に低くなる傾向があります。強い緩衝能のある緩衝液を用いるとpHの低下を防ぐことは出来ますが、一般にはpHの低下で細胞の元気のよさを判断できます。ウイルスの感染により細胞が死ぬと培養液のpHは低下しなくなります。炭酸ガスフラン器等を必要としないので、どこででも細胞を培養できる利点があります。一方、シャーレ培養は、通常5%に二酸化炭素を含む空気を供給し、落下細菌の混入を防ぐ意味でフタ、綿の栓やアルミホイルをした半開放系の培養方式です。培養の環境が安定しているので、環境の変化で増殖が変わる細胞や細胞のクローニングの場合にとても有効です。近頃話題になっているクローン動物を誕生させる核移植や体外受精を行う細胞の培養は、もっぱらこのシャーレ培養に近い方法で細胞を培養しています。高湿度の環境内での培養ですから、細菌汚染の防止に厳重な注意と対策が必要となります。

3)培養細胞の性質の違いによる初代培養、二次培養と株化細胞

 培養細胞は、その性質から初代培養、二次培養、株化細胞等に分けられます。初代培養とは、生体より組織を取り出し、トリプシンなどの細胞分散剤を用いて細胞をバラバラにし、培養に移した状態の細胞をいいます。通常初代培養は、培養容器の壁に付着して静置培養に適した状態で、またその組織を構成していた色々な細胞が集団で混在する特徴があります。初代培養は再び細胞分散剤でバラバラにして、次の新しい培養容器に移すことができます。この植え継ぐ操作を継代といい、継代して新たにできた培養を二次(または二代)培養といいます。通状の組織ならば、例外なく細胞の構成や性質の変化なしに5−6代の継代が可能です。これ以降になると、動物の種や組織にも依りますが、急速に継代後の細胞の培養容器面への着床がわるくなり、数代で全て死滅してしまいます。ニワトリの胎児の細胞は、あまり継代できず数代で増殖しなくなり死滅します。ヒトやマウスの細胞は、数十代継代することができます。しかし、体表を形成している上皮形の偏平な細胞は、ウイルスに対して感受性が高いなどの特徴がありますが、筋肉などを形成している紡錘形の線維芽細胞より継代培養は一般に難しいようです。細胞は継代培養中に細胞の形、増殖力、栄養要求性や染色体構成などが変異し、ほぼ無限に継代が可能な細胞集団に変化することが希にあります。特定の性質をもち継代可能な細胞を株化細胞といい、染色体数は2倍体から異倍体になつています。アメリカ黒人の子宮ガンから取り出された子宮ガン由来の株化細胞にHeLa細胞(ヒーラと呼びます)というのがあります。この細胞は、多くのウイルスが良く増殖し、特別な栄養成分を必要とせず、継代するのも容易であることから、世界中の研究室で50年以上も使われ続けています。

4) 細胞の維持状態の違いによる静置培養と浮遊培養.

 培養する細胞を培養容器等の表面に付着させて培養する方法を静置培養と呼びます。本来物質へ付着しないリンパ細胞など、または普通の物質への付着性のある細胞などを培養容器表面への付着を防ぎつつ分裂・増殖させる方法を浮遊培養と言います。

 静置培養は、通常四角な培養容器の一辺のみの表面に細胞を付着させて培養するので、一定面積で培養できる細胞数はあまり多くなりません。しかし、丸い培養容器を回転させてビンの内面全体に細胞を付着させたり、または中空糸など繊維状の支持体ならびにセラミックスの小さな粒子などの表面に細胞を付着させて一定面積あたりの細胞密度を高くすることも現在では可能となりました。浮遊培養は、培養液中のカルシウムイオン濃度を低くして支持体表面への細胞の付着を防ぎ、リン酸イオンを高くして細胞の増殖を促進させ、更にマグネチックスターラーで培養液ごと攪拌して細胞を浮遊させることで可能になります。また最近では特殊なゼラチンやセラミックの小粒子状の細胞支持体に細胞を付着させ、小粒子の支持体を攪拌するか、または攪拌の代わりに培養液を循環させる方法などが用いられます。浮遊培養は、一定容積の培養液中の細胞数を多くすることが出来るのが特徴です。

5) 単層培養の種類.

 細胞分散剤を用いて、組織片より細胞をバラバラにして培養容器上に付着させ、一層の細胞層を作らせる培養法を単層培養と呼びます。少し難しいのですが、染色体が2nの正常な細胞は、お互いの細胞同士が殖えてきて接触すると増殖が止まる接触阻止と呼ばれる現象を受けやすいという特徴があります。細胞が増殖を繰り返して培養面に細胞が一杯になって、細胞同士が接触すると細胞の単層が形成されます。それ以上の細胞増殖がおこらないので細胞数は増加せず、DNA合成の認められない静止期に入ります。

 一層の細胞層を作らせる培養法にも、細胞を接着させる支持体の形状からカバースリップ培養とスライドチェンバー培養とがあります。カバースリップ培養は、培養容器中にカバーグラス(カラスの短冊)を入れておき、このガラス上に単層培養を作らせる方法です。カバーグラスを取り出して染色して、顕微鏡観察標本として用いるのに便利です。スライドチェンバー培養は、スライドグラス上に張り付けたプラスチックの小さな枠内を培養容器として単層培養を行う培養法です。この枠をはずした後、細胞を観察するのに用います。

 これとは別に、単層培養を丸型の培養容器ごと回転させるローラーチューブ培養とローラーボトル培養とがあります。培養細胞を培養液と空気を一定の間隔で接触を繰り返させるために、回転板または回転棒上に試験管や培養ビンを斜めに固定し、回転させる培養法です。この方法では、細胞が空気と接触できること、細胞数に比較して培養液を少なくできること等が他の培養法と違う点で、ウイルスの収量等を多くすることができる特徴があります。

6) 培養の仕方:メイトランド法と血漿クロット法.

 生体より組織を切り出し、細胞分散剤を用いて細胞をバラバラにして培養する細胞培養法、と分散剤を用いず細胞をバラバラにしないで培養するメイトランド法と血漿クロット法とに分けられる。細胞の増殖に適した培養液が見つかるまでの時期には広く用いられた方法です。メイトランド法は、組織片または膜状組織を培養液に単に浮遊させて細胞を維持する方法です。器官培養は、この範疇に入ります。血漿クロット法は、組織片を血漿の繊維中に埋め込んで組織片の細胞を維持または増殖させる方法です。

7) 細胞培養と培養細胞の将来展望 

 特殊な細胞の培養が可能となった結果、体外受精や受精卵の試験管内培養、核の細胞内移植による新しい生命を誕生させられる技術が実用化されています。また胎児細胞を動物個体にまで生育できる技術も開発されています。今後は細胞の眠っている遺伝子を外から刺激を加えて目を覚まさせることも可能となりましょう。とすると如何なる人間の希望にも適った細胞を作り培養することが可能となります。

 遺伝子や細胞核を操作して特殊な細胞を作りだし、それを培養する技術を用いて、優秀な経済動物の品種改良、人造臓器の生産、自己の臓器または細胞の培養と保存の後の自己への移植、輸血用血液細胞の生体外生産、食肉タンパクの製造などの細胞培養技術の工業的応用に向けた研究が活発化するでありましょう。受精卵や胚(または胎児)の細胞操作、異種細胞の融合技術などに裏打ちされた現代の花形科学は、21世紀の生物学の中核を担う旗手となることでしょう。

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