核酸であるDNAを分解して、デオキシリボースの5'末端にリン酸基をもったヌクレオチド(塩基-デオキシリボース-リン酸)を2個(ジヌクレオチド)または数個(オリゴヌクレオチド)生成する酵素である。最初に発見されたウシ膵臓のDNase Iが最もよく知られている。この酵素は1本鎖DNAより2本鎖DNAに対して作用しやすい。デオキシ･プリンヌクレオチドとデオキシ･ピリミジンヌクレオチドの間のホスホジエステル結合の5'側が優先的に切断される。
黄色ブドウ球菌、セラチア、フラボバクテリウムなどの細菌がこの酵素を産生する。細菌のDNaseテストはDNase寒天にメチル･グリーンまたはトルイジン･ブルーを加えた培地で培養して、赤紫色に変色するとDNase陽性と判定する。